Secugen
Secugen - Soluciones Técnicas - Doble Secuencia
Aspecto de la secuencia.
Ejemplo.
- Se observan picos dobles o múltiples con la misma, o diferente altura, solapándose.
- El dato crudo muestra una señal suficiente lo que indica que la reacción de secuenciación ha sido eficiente, es decir los picos dobles no se deben a una señal débil o ruido de fondo.
Ejemplo.
Dimeros de Cebador
Indel
Contaminación del Clon
Dos Cebadores
Causas posibles.
- Los productos de PCR no se han purificado adecuadamente. En este caso los cebadores residuales de la PCR pueden actuar como cebadores en la reacción de secuenciación.
- El producto de PCR puede ser heterocigoto debido a indels presente en un organismo diploide o poliploide.
- Contaminación del clon. En este caso el comienzo de la secuencia tiene a menudo buena calidad y a partir de un punto se observa doble secuencia, debido a la existencia de dos clones con insertos diferentes.
- Adición de dos cebadores a la reacción de secuenciación.
- La reacción de PCR genera más de un producto y ambos son secuenciados.
- Existencia de otra zona en el molde donde el cebador puede unirse.
Tratamiento.
- Si se sospecha que el clon está contaminado se recomienda plaquear de nuevo en medio selectivo y seleccionar otros clones.
- Si se sospecha heterogeneidad o heterocigosidad en el producto de PCR, el examen de la zona con doble secuencia puede dar información. Nuevos cebadores de PCR que produzcan fragmentos menores pueden ayudar a identificar el área problemática. De modo alternativo se puede rediseñar el cebador de secuenciación o clonar el fragmento de PCR para su secuenciación independiente.
- Comprobar que solo hay un amplicón como producto de la reacción de PCR analizando por electroforesis en un gel de agarosa.
- Si se sospecha que se ha añadido más de un cebador, repetir la reacción. Si hay posibilidad de que la dilución de trabajo esté contaminada, volver al tubo original u obtener nuevo cebador.
- Comprobar el protocolo de purificación de productos de PCR y las soluciones empleadas.
- Comprobar que la secuencia del cebador está presente en el molde. Si no se conoce la secuencia puede ser necesario diseñar un nuevo cebador.