Secugen - Doble Secuencia
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Secugen - Soluciones Técnicas - Doble Secuencia

Aspecto de la secuencia.

  • Se observan picos dobles o múltiples con la misma, o diferente altura, solapándose.
  • El dato crudo muestra una señal suficiente lo que indica que la reacción de secuenciación ha sido eficiente, es decir los picos dobles no se deben a una señal débil o ruido de fondo.

Ejemplo.

Dimeros de Cebador

Indel

dimeros de cebador
indel

Contaminación del Clon

Dos Cebadores

contaminacion del clon
dos cebadores

Causas posibles.

  • Los productos de PCR no se han purificado adecuadamente. En este caso los cebadores residuales de la PCR pueden actuar como cebadores en la reacción de secuenciación.
  • El producto de PCR puede ser heterocigoto debido a indels presente en un organismo diploide o poliploide.
  • Contaminación del clon. En este caso el comienzo de la secuencia tiene a menudo buena calidad y a partir de un punto se observa doble secuencia, debido a la existencia de dos clones con insertos diferentes.
  • Adición de dos cebadores a la reacción de secuenciación.
  • La reacción de PCR genera más de un producto y ambos son secuenciados.
  • Existencia de otra zona en el molde donde el cebador puede unirse.

Tratamiento.

  • Si se sospecha que el clon está contaminado se recomienda plaquear de nuevo en medio selectivo y seleccionar otros clones.
  • Si se sospecha heterogeneidad o heterocigosidad en el producto de PCR, el examen de la zona con doble secuencia puede dar información. Nuevos cebadores de PCR que produzcan fragmentos menores pueden ayudar a identificar el área problemática. De modo alternativo se puede rediseñar el cebador de secuenciación o clonar el fragmento de PCR para su secuenciación independiente.
  • Comprobar que solo hay un amplicón como producto de la reacción de PCR analizando por electroforesis en un gel de agarosa.
  • Si se sospecha que se ha añadido más de un cebador, repetir la reacción. Si hay posibilidad de que la dilución de trabajo esté contaminada, volver al tubo original u obtener nuevo cebador.
  • Comprobar el protocolo de purificación de productos de PCR y las soluciones empleadas.
  • Comprobar que la secuencia del cebador está presente en el molde. Si no se conoce la secuencia puede ser necesario diseñar un nuevo cebador.